blog

Mar 18, 2023

Um método simples para fazer, prender e deformar uma vesícula em um gel

Relatórios Científicos volume 13,

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 5375 (2023) Citar este artigo

1406 Acessos

5 Altmétrica

Detalhes das métricas

Apresentamos um método simples para produzir pseudo-vesículas lipídicas gigantes (vesículas com uma tampa oleosa no topo), aprisionadas em um gel de agarose. O método pode ser implementado usando apenas uma micropipeta regular e se baseia na formação de uma gota dupla de água/óleo/água em agarose líquida. Caracterizamos a vesícula produzida com imagens de fluorescência e estabelecemos a presença e integridade da bicamada lipídica pela inserção bem-sucedida de proteínas transmembrana \(\alpha \)-Hemolysin. Finalmente, mostramos que a vesícula pode ser facilmente deformada mecanicamente, de forma não intrusiva, indentando a superfície do gel.

As vesículas têm sido amplamente utilizadas para imitar a compartimentalização celular e reproduzir in vitro funções biológicas específicas com abordagens de baixo para cima1,2. Em muitos estudos recentes, o foco foi colocado no encapsulamento de reações biológicas complexas dentro das vesículas, a fim de expressar proteínas3 ou genes4, ou para reconstituir e estudar os filamentos proteicos do citoesqueleto, como o córtex de actina5 ou ásteres de microtúbulos6. Muitos outros trabalhos visam mimetizar as propriedades da membrana celular, como por exemplo a fusão de membranas7,8,9, ou comunicação celular, através da inserção de proteínas transmembrana em lipossomas. Em particular, canais mecanossensíveis10,11 foram inseridos na membrana dos lipossomas, permitindo, por sua vez, medir sua condutância sob estresse mecânico.

A produção de vesículas geralmente depende de métodos de hidratação ou modelos de emulsão invertidos. Os métodos de hidratação dependem do intumescimento de filmes lipídicos secos em um tampão aquoso12,13. Eles são relativamente simples de operar, mas produzem tamanhos de vesículas polidispersos e uma eficiência de encapsulamento relativamente não homogênea14,15,16. A taxa de produção de vesículas unilamelares pode ser melhorada usando campos elétricos (métodos de eletroformação17), mas proteínas frágeis podem ser danificadas pelos campos aplicados18,19 e a técnica também é limitada a tampões com baixas concentrações iônicas. Já os templates de emulsão invertida são baseados na passagem forçada de gotículas de uma emulsão água-em-óleo através de uma interface água/óleo5,20. Este método pode ser desenvolvido em chips microfluídicos21,22,23,24, produzindo tamanhos de vesículas monodispersas, que são limitadas pelas dimensões do canal microfluídico.

Em ambos os métodos (hidratação ou emulsões), as vesículas resultantes são dispersas no meio externo, o que requer etapas adicionais para manuseá-las ou transferi-las em diferentes ambientes (micropipetas25, armadilhas ópticas26, etc). Essas etapas extras, baseadas em habilidades técnicas específicas, dificultam a replicação de muitos experimentos e coletam grandes estatísticas sobre as propriedades dos sistemas. Em particular, para estudar os processos de mecanotransdução, é necessário estimular mecanicamente as vesículas. Na prática, isso geralmente é obtido com deformações locais da membrana (sucção da pipeta27, fluxos de fluidos28,29, AFM30,31). No entanto, esses métodos não reproduzem fielmente a natureza das perturbações mecânicas nos tecidos. Além disso, eles ignoram o acoplamento mecânico entre as células e seu ambiente viscoelástico biológico.

Propomos aqui uma nova técnica, que fornece uma plataforma versátil para a produção direta de pseudo-vesículas biomiméticas (uma vesícula com uma tampa oleosa no topo), mas também permite seu aprisionamento e excitação mecânica não intrusiva.

(a–f) (linha superior) Esboço do método de produção de dupla emulsão. As cores verde/laranja/azul representam as fases interna/óleo/externa, respectivamente. (linha inferior) Imagens de campo claro. Barras de escala = 500 \(\mu \)m. A gota de emulsão dupla produzida em (f) sedimenta na agarose líquida e eventualmente fica presa como os géis de agarose. Simultaneamente, o invólucro de óleo circundante forma um creme no topo da gota e uma bicamada lipídica é compactada na parte inferior. Alguns minutos depois, a pseudo-vesícula foi formada e está aprisionada no gel, conforme esboçado em (g). Painel inferior: imagem macroscópica de fluorescência de uma pseudo-vesícula carregada com carboxifluoresceína presa em um gel de agarose. Barra de escala = 200 \(\mu \)m.